Test direktne imunofluorescencije na besnilo (FAT)
Najčešće korišćen test za dijagnozu besnila je FAT, koji preporučuju
WHO i OIE. Ovaj test se koristi direktno na tkivnom razmazu otisku moždanog tkiva.
Ovim testom potvrđuje se prisustvo antigena virusa besnila u inficiranoj ćeliji, odnosno tkivu.
FAT je veoma osetljiv i specifičan (između 96% i 99%), i daje pouzdane rezultate na svežim uzorcima za manje od 2 sata. Osetljivost zavisi od uzorka, stepena autolize i tipa uzorka.
Tkivne otiske treba pripremiti iz kompozitnog uzorka moždanog tkiva koji uključuje moždano stablo i mali mozak. Ako mali mozak nije dostupan, mogu se koristiti Amonovi rogovi. Otisci se fiksiraju u 100%-tnom, hladnom acetonu (–20 ° S) najmanje 20 minuta. Zatim se osuše na vazduhu i zatim oboje sa specifičnim FITC-om (fluorescein izotiocijanat) obeleženim specifičnim antitelom (poliklonsko ili monoklonsko antitelo protiv besnila).
Ovaj konjugat, razblažen do radnog razređenja se ostavlja da reaguje sa antigenom u otisku za 30 minuta na 37° S u vlažnoj komori. Zatim se ispiraju slajdovi i posmatra se specifična fluorescencija korišćenjem fluorescentnog mikroskopa i filtera pogodne talasne dužine (apsorpcija na 490 nm i emisija na preko 510 nm).
Agregati nukleokapsidnog proteina se identifikuju specifičnom fluorescencijom vezanog konjugata. Preporučuje se da dva nezavisno obučena operatera čitaju svaki FAT slajd. Konzervirana antigena mesta na nukleokapsidnom proteinu virusa besnila dozvoljavaju identifikaciju svih lisavirusa sa modernim komercijalnim preparatima konjugata koji se koriste za dijagnostičke testove. FAT se može primeniti i na uzorke sačuvane u glicerolu nakon koraka pranja. Ako je uzorak je sačuvan u rastvoru formalina, FAT se može koristiti tek posle tretiranja uzorka proteolitičkim enzimom. Međutim, FAT je na formalinom fiksiranim i digestiranim uzorcima uvek manje pouzdan i nego kada se obavlja na svežem tkivu.
